近日，一项题为“N1-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting”的研究在《自然》杂志上发表，整个研究探讨在信使核糖核酸（mRNAs）中添加N1甲基假哌啶（1-甲基Ψ）对核糖体移码和翻译准确性的影响。

体外转录（IVT）mRNA被用作对抗人类疾病的一种方法，例如作为SARS-CoV-2疫苗。IVT mRNA被转染到靶细胞中，然后被翻译成重组蛋白，其编码的蛋白具有预期的治疗效果。治疗性IVT mRNA通常会添加修饰的核糖核苷酸，以降低其免疫原性，但对其对翻译准确性的影响尚未得到充分探讨。最近的研究发现，N1甲基假哌啶的添加会导致+1核糖体移码。

  在本研究中，研究人员采用了多种方法合成和分析修饰的信使核糖核酸。对于质粒和信使核糖核酸合成，研究人员使用Phusion高保真脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶试剂，并为野生型（WT）和移码萤火虫萤光素酶（Fluc）创建模板DNA。使用TranscriptAid T7高产转录试剂盒转录定制基因以进行不同的mRNA修饰。转录物用核苷酸如5-甲氧基UTP、N1甲基假多UTP或5-甲基CTP进行修饰，并进行纯化和定量以用于进一步的实验。

对于RNA凝胶电泳，用甲酰胺和染料制备样品，然后在琼脂糖凝胶上解析，用溴化乙锭染色，并在紫外线下观察。该研究涉及用修饰的mRNA培养和转染HeLa细胞，并评估转染后的荧光素酶活性。他们还使用Flexi兔网织细胞裂解物系统进行体外翻译，结合[35S]蛋氨酸进行标记。

该研究利用肽液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）分析来鉴定翻译产物，并利用质谱法分析凝胶消化物。使用Proteome Discoverer软件处理质谱数据。此外，研究人员使用NextFlex快速定向RNA-seq试剂盒和Illumina MiSeq测序对IVT mRNA进行了RNA测序分析。

为了获得进一步的见解，研究人员使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）放射自显影法，并定量翻译的信使核糖核酸中掺入的[35S]甲硫氨酸。通过小鼠免疫研究、测量免疫反应的干扰素-γ酶联免疫斑点（IFNγELISpot）测定和人类供体的人类白细胞抗原（HLA）基因分型来了解与疫苗反应相关的基因组成。

最终的研究表明，1-甲基Ψ修饰的核糖核苷酸显著增加了信使RNA翻译过程中的+1核糖体移码，并且含有该修饰的mRNA接种后可引发对+1移码产物的细胞免疫。这是第一份关于mRNA修饰影响核糖体移码的报告。除了影响宿主T细胞免疫外，核糖体移码的副作用可能包括增加新的B细胞抗原的产生。其他核糖核苷酸修饰策略会显著降低IVT mRNA的翻译效率，可能限制临床应用。研究还发现，含有1-甲基Ψ的mRNA翻译导致较慢的翻译延伸，这是由氨基酰-tRNA结合的改变引起的。这些发现对于我们深入了解核糖核苷酸修饰如何影响mRNA翻译以及设计和优化未来的mRNA治疗方法具有重要意义，可以避免可能降低疗效或增加毒性的误译事件。