近年来，RNA疗法正以前所未有的速度重塑现代医学格局。从新冠mRNA疫苗的全球部署，到反义寡核苷酸（ASO）药物如Nusinersen（用于脊髓性肌萎缩症）和Inotersen（用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性）的获批上市，再到小干扰RNA（siRNA）药物Patisiran的成功商业化，核酸药物已从实验室走向临床现实。然而，这些突破性疗法的背后，隐藏着一个长期被忽视却至关重要的挑战：如何高效、可持续且经济地生产其核心原料——修饰型核苷三磷酸（NTPs）？
传统化学合成NTP的方法主要基于Yoshikawa或Ludwig-Eckstein等经典路线，依赖高活性的三价磷（P(III)）试剂。这类方法不仅对水分和氧气极度敏感，还需使用大量保护基团以避免副反应，最终导致步骤冗长、收率低下（常低于30%），且纯化过程复杂。更严峻的是，许多具有优异药代动力学特性的2′-位糖环修饰（如2′-O-甲氧乙基、2′-氟、锁核酸LNA等）会显著降低反应活性，使得化学合成成本居高不下，严重制约了RNA药物的大规模应用。
为突破这一瓶颈，曼彻斯特大学曼彻斯特生物技术研究所（MIB）、基尔大学糖科学中心与英国酶工程公司Prozomix联合团队，在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了一项里程碑式研究，提出了一种完全不依赖ATP、仅使用廉价无机磷酸盐供体的三步酶级联合成平台，实现了多种治疗级NTP的高效、绿色制备。
该平台的核心创新在于巧妙规避了传统生物催化路径对ATP的依赖。在自然界中，细胞通过激酶利用ATP将核苷逐步磷酸化为NMP、NDP直至NTP。然而，ATP本身价格昂贵，且其副产物ADP/AMP极难与结构高度相似的目标NTP（如2′-F-ATP）分离。微量ATP残留还会在后续的酶法寡核苷酸合成中引发非特异性掺入，导致产物序列杂乱，严重影响药物纯度与疗效。
研究团队另辟蹊径，设计了一条全新的“无ATP”路径：
第一步：利用工程化的酸性磷酸酶（PhoC）以焦磷酸盐（PPi）为磷酸供体，将商业可得的修饰核苷直接转化为5′-单磷酸核苷（NMP）；
第二步：引入多聚磷酸激酶（PPK），利用廉价的多聚磷酸盐（PolyP）驱动热力学平衡，将NMP转化为NDP/NTP混合物；
第三步：加入乙酸激酶（AcK），以乙酰磷酸为供体，将残留NDP完全转化为目标NTP，从而最大化产率。
这一策略的关键在于第一步的高效与选择性。天然PhoC虽具广谱活性，但对2′-大位阻修饰（如2′-MOE）活性极低，且易水解产物NMP。为此，团队以2′-MOE-腺苷为模型底物，开展了定向进化。通过两轮饱和突变（共筛选超3500个克隆），成功获得PhoC_4变体（含A90E、N151A、D154L三个突变）。X射线晶体结构解析（分辨率2.0 Å）显示，这些突变位于柔性环区与活性口袋边缘，可能通过调节构象动态性增强底物结合与磷酸转移效率。动力学测试表明，PhoC_4对2′-MOE-A的kcat/KM提升9倍，转化率从12%跃升至96%。
更令人振奋的是，PhoC_4展现出惊人的底物普适性。它不仅能高效处理所有四种碱基（A、U、C、G）的2′-MOE、2′-F、2′-OMe修饰核苷，还能兼容锁核酸（LNA）及3′-烯丙基/叠氮等保护基团——后者正是非模板依赖型酶法合成（如TdT或Poly(U)聚合酶系统）所必需的关键中间体。在100 mM底物浓度、仅20 µM酶载量下，PhoC_4仍能维持高转化率，并耐受10% DMSO，展现出工业化潜力。
在完整级联系统中，团队成功合成了9种结构各异的NTP，总转化率达40–82%。克级实验显示，163 mg 2′-MOE-A可转化为2′-MOE-ATP（76%转化率），经DEAE Sepharose纯化后得率65%，纯度>99%。而713 mg 2′-F-腺苷则以77%转化率生成2′-F-ATP。
尤为关键的是，粗产物无需纯化即可直接用于下游合成。研究者将酶法制备的2′-F-ATP粗品投入工程化DNA聚合酶（Tgo2M）与内切酶V（EndoV）的级联系统，成功合成8聚2′-F-RNA，转化率达70%。对照实验表明，即使掺入1–10 mol% ATP杂质，也会导致产物序列混乱，凸显本平台“无ATP”设计的不可替代优势。
这项工作不仅解决了NTP合成的工艺难题，更展示了合成生物学驱动绿色制药的典范：以水为溶剂、酶为催化剂、无机盐为原料，全程避免有毒试剂与复杂纯化，符合绿色化学十二原则。未来，通过进一步优化酶的pH兼容性、开发结晶纯化工艺、拓展底物范围，该平台有望成为RNA药物CMC（化学、制造与控制）环节的标准解决方案，加速全球核酸药物的可及性与可负担性。
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