一、研究背景
APA 的生物学与临床重要性：真核基因普遍存在多个 polyadenylation site（PAS），通过替代使用（APA）可产生 3′-UTR 长短不同的转录本，进而影响 mRNA 稳定性、核输出、翻译效率、亚细胞定位以及蛋白质功能。许多疾病（癌症、神经退行性病变等）中 APA 失衡被认为是重要的调控层面，但“为什么选择某个 PAS”仍是未解之谜。
RNA G-quadruplex（rG4）与 RNA 调控：rG4 是富含鸟嘌呤的 RNA 序列可折叠成四链堆叠的非典型二级结构，已知在 5′-UTR/编码区等处调节翻译或剪接。此前零星研究提示 3′-UTR 的 rG4 也可能影响 APA（例如 LRP5、FXR1 的早期研究），但系统证据较少。作者因此提出：rG4 究竟在转录后 3′-端加工（polyadenylation）的位点选择中，是否扮演可调节“开关”角色？这是本文的核心问题。
二、研究方法
化学工具与细胞处理
使用已知 rG4 稳定剂 RHPS4（3,11-Difluoro-… acridinium methylsulfate），在 HEK-293T 细胞中以 IC20（经 MTT 试验确定为 1.5 μM）处理 72 小时，作为“稳态增强 rG4 的干预条件”。
转录本 3′ 端定量测序：PolyA Click-seq（PAC-seq）
提取总 RNA，送 ClickSeq 技术平台构建 3′-端文库；用 DPAC 管线定位 PolyA cluster（PAC），并用 DESeq2/DPAC 比较 RHPS4 处理与对照之间的差异，定义 APA 事件（阈值：ΔPDU ≥10% 且 p-adj <0.1；为降低假阳性另设 ΔPDU ≥12% 过滤）。全转录组共观察 14,819 个带 PAC 的基因。
生物信息学筛选 rG4
在每个 PAC 上下游 ±100 nt 内用 G4RNA Screener（整合 G4Hunter、cG/cC、G4NN）打分并设门限（G4H >0.9 或 G4NN >0.5 或 cG/cC >4.5）以识别高置信度 pG4。经过过滤（剔除剪接类事件、选择 ΔPDU ≥12%），缩小到 15 个候选基因，含 27 个 pG4 供后续实验验证。
体外与细胞内验证（以 NEO1 为示范）
NEO1 的 3′-UTR 被识别含 两个 pG4（proximal 与 distal）：proximal 位于距 PAC2 下游 ~32 nt，distal 于距 PAC3 上游 ~59 nt。作者合成对应 RNA 片段并进行：
NMM 荧光“light-up”实验（检测 rG4 与 N-甲基-mesoporphyrin IX 结合所致荧光增强）；
RT-stop（Reverse Transcriptase Stop） 实验（rG4 会阻滞逆转录酶延伸，显示特征性提前停止条带）；
点突变（G→A）构建（使 pG4 无法折叠），并将完整 3′-UTR（WT 与突变体）拼接到 GFP 报告载体，细胞转染后用 Northern blot 定量长/短 3′-UTR 型（LU vs SU），计算 PDUI（LU/(LU+SU)）；并用 actinomycin D 做 mRNA 稳定性测定以排除稳定性差异导致的伪信号。
统计与控件
多重生物学重复（PAC-seq 三个生物复；北方印迹与 RT-stop 三次实验），并以合理阈值和多方法交叉验证确保结论稳健。
三、研究结果
RHPS4 大规模重塑 APA 景观
PAC-seq 显示，在 14,819 个基因中，498 个基因表达显著差异（>1.5×，p-adj<0.1）；并检测到 297 个显著 APA 事件（包括短化、延长、剪接相关与混合事件），总体约 37% 的可检测 exon 在 PDUI 上有响应（即 APA 受 RHPS4 干预普遍影响）。这表明 G4-ligand 对 APA 的全球性影响显著。
pG4 在 PAC 附近高丰度且与 APA 变化相关
在严格筛选下，151/181（83%） 的候选基因在 PAC 附近检测到 pG4，最终挑选出的 15 个基因含 27 个高置信度 pG4，其邻近 PAC 的存在与 RHPS4-诱导的 APA 变化高度相关（生物信息学与实验证据互相支撑）。
NEO1：远端（distal）rG4 对 APA 的决定性作用
对 NEO1 的深入验证给出清晰的机制线索：在原生细胞中，RHPS4 处理使 NEO1 的远端 PolyA 使用率（PDUI）由 ~37% 提升到 55%，即长 3′-UTR 异构体显著增加（+18%）。在 GFP-3′-UTR 报告体系中，野生型 PDUI≈0.22；proximal G→A 突变后 PDUI≈0.25（无显著变化），而distal G→A 突变将 PDUI 降至 ≈0.11，双突变为 ≈0.15。换言之，distal rG4 的完整性对远端 PAS 的使用至关重要，其损失偏向短 3′-UTR（SU）产生。
生物物理验证：proximal vs distal 的差异
NMM 荧光显示 proximal rG4 在体外易自发折叠并强烈结合 NMM（F/F0 ≈ 40），而 distal 在无配体条件下荧光信号弱；RT-stop 在 K+ 条件下与 RHPS4 存在时可观察到 distal 的弱性 rG4 阻滞并随 RHPS4 强化，证明 RHPS4 可稳定在细胞中相对弱的 distal rG4，从而影响 APA。
可能的转录后网络效应
转录组分析表明，RHPS4 处理同时伴随某些核心 APA 因子（如 FIP1L1）表达上调；FIP1L1 的上调已知促进 distal PAS 使用，提示 rG4-介导的 APA 重编程可能既有直接的“局部结构-位点阻隔/招募”效应，也可能通过改变 APA 因子表达间接放大。总体上 APA 对应的长度变化呈异质性（既有短化也有延长事件），反映复杂调控网络。
限度与方法学考虑
作者明确指出：使用 G4-ligand（即使选择像 RHPS4 这样不强烈诱导新 G4 的配体）仍可能改变 G4 的天然分布；此外 PAC-seq 的统计阈值选择会影响事件判定，故结合多重验证（in silico + in vitro + 细胞实验）是必要的保障。
四、启发
1. 科学与机制层面
rG4 可成为 APA 的“可塑性开关”：本研究系统性地将 rG4 与 APA 连接起来，说明 RNA 二级结构（尤其 3′-UTR 附近的 rG4）能直接影响 polyA-site 的选择，从而塑造转录本异构体谱。这一发现将拓宽转录后调控的范畴，把结构层面纳入解释 APA 可变性的关键因子。
“位点-结构-因子”三维调控模型：rG4 的存在/稳定性可直接机械性阻挡或招募处理复合体，且可能与 APA 因子（如 FIP1L1）表达水平协同，提示在不同生理或药理条件下 APA 可被多层次调控。
2. 技术与应用前景
RNA 疗法与 mRNA 设计：3′-UTR 的长度与序列直接影响 mRNA 药物的表达动力学、局部化和免疫原性。通过在 3′-UTR 合理设计或操纵 rG4（或使用小分子稳定剂/拮抗剂）可能成为优化 mRNA 疗法、控制翻译/半衰期的新策略。作者亦提出“合成 G-quadruplex”用于设计优先产生更稳定异构体的概念，具有产业化潜力。
靶向癌症与疾病的策略：NEO1 与若干癌症相关；若 rG4-介导的 APA 改变实质上影响蛋白功能或定位，则调节该 rG4（小分子或反义核酸）可能成为干预路径之一（需进一步体内与功能性验证）。
3. 建议的后续研究与开发路径
功能关联实验：将 APA 改变与蛋白水平、亚细胞定位与细胞表型（迁移、增殖、分化）直接关联，特别是对 NEO1 在肿瘤模型或发育模型中的功能性验证。
在体与临床相关模型扩展：将发现从 HEK-293T 扩展到原代细胞或肿瘤样本，评估 rG4-APA 在真实生理/病理背景下的普适性与可塑性。
药物化学与设计：筛选或设计选择性更高、诱导效应更可控的 rG4 調節小分子，或者开发基于核酸的“结构屏蔽/诱导”工具（ASO、LNA、结构化 RNA 适配体）以精准调控单个 PAS。
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